产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的E.coli细胞DNA进行分析。

• 线性范围：3.00E+02~3.00E-02pg/μL；R2≥0.990；扩增效率为97.5%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：3.00E-02pg/μL

• 专属性：不受CHO、293T、毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在30%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至3.00E-02pg/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

SHENTEK® E.coli HCD 检测试剂盒(PCR-荧光探针法)是用于定量检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 E.coli 宿主细胞 DNA 的专用试剂盒。本试剂盒利用荧光探针原理，定量检测样品中 E.coli 残留 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。

试剂盒配套有 E.coli DNA 定量参考品，已溯源至国家标准品。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的 E.coli DNA。

该试剂盒仅供研究使用，不可用于诊断。

n试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

1.  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

2.  7500 Real-Time PCR System

3.  CFX96 定量 PCR 系统

4.  Roche 480

n  实验所需但试剂盒中未含材料

1.   1.5 mL 无菌低吸附离心管

2.   96 孔 qPCR 板

3.   1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

1.   荧光定量 PCR 仪

2.   1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪

3.   迷你离心机

4.   漩涡振荡器

n  实验操作流程

图 1 操作流程示意图

一、试剂、仪器准备

（一）实验前准备：

1.         穿戴适当的工作及保护服, 至少穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。

2.         工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。

3.         将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。

（二）qPCR 反应液准备：

1.       反应孔数计算：根据检测样品的数量，计算所需反应孔数，一般做 3个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       MIX 总量计算：根据反应孔数计算所需 MIX 总量。

MIX 总量 =（反应孔数+2）× 20 μL（含有 2 孔的损失量）

3.      qPCR MIX 配制：根据表 2 配制表准备各试剂 qPCR MIX 用量。表 2. qPCR MIX 配制表

将 qPCR MIX 充分混匀后按照 20 μL/管分装至 8 联管或 96 孔板中，置于冰上或 2-8℃条件下备用。

二、样品准备

l E.coli DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

E.coli  DNA  定量参考品的浓度标注于管壁标签，请确认后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 E.coli DNA 定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1.      将试剂盒中的 E.coli DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化，待完全融化后，轻弹数下或震荡混匀，短时间快速离心 3~5 秒，如此重复 3 次。

2.      取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3， ST4，ST5。

3.      在ST0 管中用DNA 稀释液将E.coli DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 秒，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.      在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5.      按表 3 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

配置好的标曲可保存于 2-8℃，仅供当天使用。建议标曲放置时间超过 1 个小时及以上，使用时需要再次混匀：轻弹数下或震荡混匀，短时间快速离心 3~5  秒，如此重复 3 次。

l  加样回收质控 ERC 的制备

根据需要设置ERC 中的E.coli DNA 加样浓度（以制备加30 pg E.coli DNA量的样品 ERC 为例），具体操作如下：

1.      取 100 μL 待测样品加入 1.5 mL 干净的离心管中。

2.      再加入 10 μL ST3，混匀，标记为样品 ERC。

备注：样品ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品ERC纯化液。

l 阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1. 取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控NCS。

备注：阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。

三、操作步骤

（一）加样

1.       各试剂置于冰上融化，轻微振荡混匀，按表 4 和表 5 所示加样：

²  该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 E.coli DNA 标准曲线（ST1～ST5）、 1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、5 个待测样品（S1～S5）和 每个样品的 ERC（S1 ERC～S5 ERC）。每个检测做 3 个重复孔。

²  实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.   将96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心10 秒后放入qPCR仪。

（二）qPCR 程序设置

l  SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例：

1.         点击“实验向导”。

2.         “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。

3.         选择步骤 2：选择项目中的“E.coli 残留 DNA”程序。

4.         “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

l  其他定量 PCR 系统程序设置如下：

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.  创建新检测探针，命名为 E.coli-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.    设置两步法反应程序：

95 ℃预变性 10 分钟；

95 ℃ 15 秒，60 ℃ 1 分钟（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。

四、结果计算与判断

（一）结果计算

l  以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.   “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 3 赋值，例如“E.coli 残留 DNA”设为 300、30、3、0.3、0.03，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

2.   待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.   在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.   在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、样品 ERC、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。

l  以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 2.4 为例。

1.   在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.   在Results 的Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.   在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔、样品 ERC 孔的 Task 一栏设置为 Unknow，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、 S、ERC，之后点击。

4.   在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.   在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品、样品 ERC 的检测值，单位为 pg/10 μL。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μL 或 pg/mL。

（二）结果判断

1.   根据待测样品和样品 ERC 的检测结果计算加样回收率，加样回收率要求在 50%～150%之间。

2.    阴性质控 NCS 的 Ct 值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。 

3．无模板对照 NTC 的检测结果应为未检出或 Ct 值≥35.00，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。

上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室的机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

生效日期：2023 年 09 月 06 日