本试剂盒用于生物制品样本的前处理，可稳定高效地获得样本中的微量宿主细胞DNA。适用于多种基质缓冲溶液，有效提取纯化微量的DNA。
可与各个 SHENTEK®宿主细胞（CHO、E.coli、Vero、酵 母、NS0、Human、MDCK、Sf9&AcNPV、Hi5&AcNPV、质粒、 SV40LTA&EIA 等）DNA qPCR 检测试剂盒配合使用。
宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒（磁珠法）用于生物制品样品的前处理，可稳定高效地获得样品中的微量宿主细胞 DNA。本试剂盒适用于多种基质缓冲溶液，有效提取纯化微量的 DNA。可与各个 SHENTEK®宿主细胞（CHO、E.coli、Vero、酵母、NS0、 Human、MDCK、Sf9&AcNPV、Hi5&AcNPV、质粒、SV40LTA&EIA 等）DNA qPCR 检测试剂盒配合使用。
本试剂盒可以手动操作，也可以通过 rHCDpurify®前处理系统实现样品的自动处理。在 rHCDpurify®中已内置相应处理程序，只需一键操作即可完成前处理。
100 Extractions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
Ø 无水乙醇（分析纯）
Ø 100%异丙醇（分析纯）
Ø 1M 的 HCl 和 NaOH
Ø 5M 的 NaCl
Ø PBS 缓冲液：1×、pH 7.4、无镁离子和钙离子（如有必要，可用于稀释样品）
Ø 一次性手套
Ø PCR 八联管或 96 孔板，相应管盖或覆膜
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 低吸附滤芯枪头
Ø 1.5 mL 低吸附离心管
Ø 迷你离心机
Ø 磁性分离架和 rHCDpurify®前处理系统
Ø 漩涡振荡器
Ø 恒温金属浴
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 超净台
Ø 96 孔微孔板混匀仪
一、试剂、仪器准备
Ø 在新开启的洗涤液 A 中加入 40 mL 的无水乙醇。
Ø 在干净的试剂瓶中用无水乙醇和灭菌超纯水配制 70%乙醇溶液，标记为洗涤液 B。
Ø 配制后的洗涤液应密封，室温保存，防止乙醇挥发（注意使用效期）。每次实验前需预先完成以下工作：
Ø 准备好 100%的异丙醇。
Ø 开启恒温金属浴，设置温度为 55 ℃、70 ℃。
Ø 蛋白酶 K 消化液配制：
使用前若发现蛋白酶 K 缓冲液出现结晶或沉淀，应 37 ℃金属浴处理，待完全溶解后，振荡混匀。
单个样品所需蛋白酶 K 消化液的准备（蛋白酶 K 使用量根据样品蛋白浓度可酌情增加）：
按照上述单个样品的蛋白酶 K 消化液用量和样品数，计算和配制本次实验所需的蛋白酶 K 消化液总体积。
Ø 工作结合液配制：
使用前若发现结合液出现结晶或沉淀，应 37 ℃金属浴处理，待完全溶解后，振荡混匀。
单个样品工作结合液的准备：200 μL 结合液 + 0.2 μL 酵母 tRNA +9 μL 糖原
如果是提取酵母 DNA 和 E.coli DNA，工作结合液中不要加酵母 tRNA。
按照上述单个样品的工作结合液用量和样品数，计算和配制本次实验所需的工作结合液总体积。
1） 先稀释后纯化：用 1×PBS（pH 7.4，无镁离子和钙离子）进行适当比例稀释后再进行样品纯化处理。
2） 先纯化后稀释：用稀释液对样品纯化后再进行稀释处理。
为了保证检测的准确性，使样品的检测值在标准曲线线性范围之内，高 DNA含量样品需要进行适当比例稀释处理（一般可考虑将高 DNA 含量样品稀释 100 倍或 1000 倍。
如果样品经过稀释，则用稀释液作为阴性对照。
1） 样品溶解及纯化：用稀释液将干粉样品进行溶解，再进行样品纯化处理。
2） 样品溶解稀释及纯化：用适当的试剂将干粉样品溶解，配成高浓度溶液，再用稀释液稀释后，进行样品纯化处理。
一般可考虑将干粉样品稀释成 10 mg/mL 或 100 mg/mL。
1） 要求：一般情况下生物制品纯化过程中间样品的 pH 值均为中性，若样品的pH<5>9，则会影响样品纯化处理效果。
2） 调节 pH：样品处理前先测试一下样品 pH 值，并可以用 1M 的 HCl 或 NaOH调整样品的 pH 至中性后（pH 6.0-8.0）再进行纯化操作。
每次实验中都需要设置一个 NCS 作为空白样品，NCS 与其他待测样品一起进行处理，以检验在样品处理过程中是否存在交叉污染或环境污染。
用 ERC 来评估 DNA 提取的效率、回收率和准确度，并可用 ERC 来评估验证分析方法和系统性能。对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜。
1. 取 100 μL 待检测样品到 1.5 mL 干净的低吸附离心管中。
2. 在所有样品中，加入 10 μL 5M NaCl，振荡混匀。
3. 加入蛋白酶 K 消化液振荡混匀，55 ℃金属浴 1 小时。
为了使样品消化更加完全，可在孵育至 30 分钟左右时再次进行涡旋振荡混匀后继续孵育。
注意样品预处理好后需尽快进行下述的 DNA 提取实验！
（一）操作过程（手工操作）
1. 磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡 5 秒。
2. 从金属浴中取出样品，快速离心 30 秒，每管样品中加入 209.2 μL 工作结合液，振荡混匀。
3. 快速离心 10 秒后在样品混合物中加入 200 μL 异丙醇，10 μL 磁珠。 
如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分振荡混匀磁珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性。
4. 将装有全部混合物的离心管置于漩涡振荡器上振荡 5 分钟，快速离心 10秒后静置于磁性分离架上。
快速离心的目的在于将附着在离心管盖和壁上的混合物甩至管底。
5. 待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。 等待磁珠完全分离的时间约为 3-5 分钟。
去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。
1. 从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液A，振荡 10秒使磁珠和洗涤液 A 混匀；快速离心 10 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 1 次磁珠洗涤。
2. 从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 B，振荡 40秒使磁珠和洗涤液 B 混匀；快速离心 10 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 2 次磁珠洗涤。
3. 为保证液体充分移除，可将离心管再次快速离心 10 秒，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用 10 μL 枪头小心的将残余液体吸除干净。
去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。
4. 从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥 30 秒-3 分钟，除去残留的乙醇。
干燥时间依具体情况而定，室温较高或空气干燥的环境下可以选择较短干燥时间；而室温较低或空气湿润环境下，干燥时间可以稍长。
1. 沿离心管壁加入 50-100 μL 70 ℃预热的洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡 5秒使磁珠和洗脱液混匀，70 ℃水浴 7 分钟，水浴过程中可再次振荡混匀 2-3次。
振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底。
振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重新震荡混匀。
2. 孵育完成后，将离心管高速离心 1 分钟，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。
3. 将上一步获得的离心管快速离心 10 秒，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样品纯化液。
收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，离心管内不得残留液体，否则将影响样品检测的准确性。
按照下述 96 深孔板排布预先加入相应溶液：
其中：
第 1 或 7 列：工作结合液 209.2 μL/孔，异丙醇 200 μL/孔以及消化后的全部样品
第 2 或 8 列：洗涤液A 700 μL/孔
第 3 或 9 列：洗涤液B 700 μL/孔
第 4 或 10 列：磁珠 15 μL/孔
第 5 或 11 列：洗脱液 100 μL/孔
消化后的样品可在其他试剂全部加完后再加。样品体积最大为 500 μL/孔。
1. 电源键打开—点击“登录”输入账号及密码—进入主页面。
2. 75%酒精棉球擦拭仪器内部—点击“紫外灯”—选择“15 分钟”。 此步骤可在提取准备操作之前进行
3. 将加好样的 96 深孔板放入仪器中固定位置，并把塑料套管插入磁头对应位置。
4. 点击“运行”—选择“rHCD-03D100”程序—扫描试剂盒上二维码—仪器运行。
5. 程序结束，发出“嘀嘀”声，立即取出深孔板，将样品纯化液全部转移到新的离心管内。
1. DNA 洗涤和洗脱操作时，每次振荡混匀后，都应该短时间快速离心，以保证没有磁珠或液体附着于离心管盖或管壁上。
2. 在每一步操作时，用左手顺时针方向环握 EP 管，大拇指轻轻地打开管盖，勿将液体溅出。
3. 在磁性分离架上分离磁珠时，中途可以适当旋转离心管，使磁珠吸附更加集中。
4. 在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱时不完全溶解。
5. 请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。
附表
修订时间：2023 年 05 月 29 日
生效日期：2023 年 06 月 01 日
规定储存条件下24 个月，具体详见试剂盒标签
400-829-0116
