n  试剂盒简介

动物源性生物材料残留 DNA 提取试剂盒（磁珠法）用于各种动物源性生物材料样品中的微量动物源 DNA 的提取纯化。本试剂盒适用于多种类型生物材料（如生物修复膜、生物补片、脱细胞基质等），有效提取纯化微量的 DNA，可用于 DNA 荧光染料法或 qPCR方法检测。

本试剂盒可以根据以下内容进行手动操作，也可以通过 rHCDpurify®实现样品的自动处理。在 rHCDpurify^®中已内置相应处理程序，参照 rHCDpurify^®的说明书只需一键操作即可完成前处理。

n  试剂盒组分

n  规格

50 Extractions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 无水乙醇(分析纯)

Ø 100%异丙醇（分析纯）

Ø PCR 八联管或 96 孔板，相应管盖或覆膜

Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附滤芯枪头

Ø 1.5 mL 无菌低吸附离心管

n  相关设备

Ø 迷你离心机

Ø 天平（0.0001 g）

Ø 磁性分离架和 rHCDpurify^® 前处理系统

Ø 漩涡震荡器

Ø 恒温水浴锅

Ø 1000 μL，200 μL，100 μL，10 μL 移液枪

Ø 荧光酶标仪或定量 PCR 仪

Ø 96 孔微孔板混匀仪

n  实验操作流程

一、试剂、仪器准备

开启新试剂盒时需完成以下工作：

Ø  在新开启的洗涤液 A 中加入 20 mL 的无水乙醇。

Ø  在干净的试剂瓶中用无水乙醇和灭菌超纯水配制 70%乙醇溶液 50 mL，标记为洗涤液 B。

Ø  配制后的洗涤液应密封，室温保存，防止乙醇挥发。每次实验前需预先完成以下工作：

Ø  准备好 100%的异丙醇。

Ø  单份样品所需的蛋白酶 K 消化液的准备：

20 μL 蛋白酶 K + 100 μL 蛋白酶 K 缓冲液 + 80 μL DEPC 水  蛋白酶 K 使用量参照样品消化情况可酌情增加。

按照上述单份样品的消化液用量和样品数，计算和配制本次实验所需的蛋白酶 K 消化液总体积。

使用前若发现蛋白酶 K 缓冲液出现结晶或沉淀，应 37 ℃水浴，待完全溶解后，震荡混匀。

蛋白酶 K 消化的完全程度会影响 DNA 的回收检测。

Ø  单份样品所需的工作结合液的准备：

200 μL 结合液 + 0.2 μL 酵母 tRNA + 9 μL 糖原

如果提取的 DNA 使用 Picogreen 染料法进行检测，工作结合液中不加酵母 tRNA。

按照上述单份样品的工作结合液用量和样品数，计算和配制本次实验所需的工作结合液总体积。

使用前若发现结合液出现结晶或沉淀，应 37 ℃水浴，待完全溶解后，震荡混匀。

二、样品处理

Ø  样品平行处理：为了确保结果的准确性，可每个待测样品设置 3 个平行样品进行 DNA 提取处理和检测。

Ø  阴性质控（NCS）：每次实验中都需要设置一个 NCS 作为空白样品，NCS 与其他待测样品一起进行处理，以检验在样品处理过程中是否存在交叉污染或环境污染。以 1×PBS 作为阴性质控。

Ø  加标回收（ERC）：用 ERC 来评估 DNA 提取的效率、回收率和准确度，并可用 ERC 来评估验证分析方法和系统性能。对具体样品的 DNA 加标量设定在其无加标测试值的 2-10 倍为宜。建议针对样品进行预测试，初步确认样品中 DNA 残留量，以选择合适的取样量，也可作为后续设定加标量的依据。为了确保结果的准确性，每个待测样品可设置 3 个平行加标样品进行 DNA提取和检测。

后续说明书中待测样品设置以：1 份未加标样品+1 份加标样品+1 份备用样品（基于损耗设置）共 3 份样品来进行设置。称量和消化液加入量都需3 倍于单份样品的量。

如每个待测样品的未加标样品和加标样品都设置平行样品，所需样品数应为 N+M+1，其中 N 为未加标样品数，M 为加标样品数，1 为损耗。称量和消化液加入量都需 N+M+1 倍于单份样品的量。

三、样品消化

1.        每个待检测样品准确称量 3 倍于单份样品的称样量并记录，剪成尽量小的碎片后放入同一管 1.5 mL DNase-free 无菌离心管中。

单份样品的称样量可由预测试结果确定。从样品检测值尽量接近方法上限或位于方法线性范围内为宜。

对于经交联剂处理过不易被酶类消化的样品，则充分匀浆后放入 1.5 mL DNase-free 无菌离心管中。

对于湿润性样品，取与待验组相同重量样品，并记录湿重，完全干燥至恒重后计算含水量计算干重，用于后续结果计算。

2.        加入 3 份蛋白酶 K 消化液振荡混匀后，56 ℃水浴 1 小时（样品完全融解，无肉眼可见颗粒）。

四、DNA 提取

（一）操作过程（手工操作）

u  结合

1.  从水浴中取出样品，涡旋混匀后分出 2 份，每份 200 μL，剩余样品舍弃，1份作为样品组，1 份作为加标回收组，根据预实验加入合适的加标量。

2.  加入工作结合液，振荡混匀。

3. 快速离心 10 秒后在每份样品混合物中分别加入 200 μL 异丙醇，30 μL 磁珠。

磁珠使用前应在漩涡振荡器充分振荡 5 秒。

如果样品较多，每次加入磁珠过程中应再次充分震荡混匀磁珠，以保证每次加入的磁珠量的一致性。

4.        将装有全部混合物的离心管置于漩涡震荡器上振荡 5 分钟，快速离心 10 秒后静置于磁性分离架上。

快速离心的目的在于将附着在离心管盖和壁上的混合物甩至管底。

5. 待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头小心移去上清。 

等待磁珠完全分离的时间约为 3-5 分钟。

去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

u  洗涤

1.        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 A，振荡 10 秒使磁珠和洗涤液 A 混匀；快速离心 10 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 1 次磁珠洗涤。

2.        从磁性分离架上取下含有磁珠的离心管，加入 700 μL 洗涤液 B，振荡 40 秒使磁珠和洗涤液 B 混匀；快速离心 10 秒后，将离心管重置于磁性分离架上。待溶液澄清，磁珠完全分离后，用枪头移去上清液，完成第 2 次磁珠洗涤。

3.        为保证液体充分移除，可将离心管再次快速离心 10 秒，置于磁性分离架上，待磁珠完全分离后，用 10 μL 枪头小心的将残余液体吸除干净。

去除上清时枪头避免搅动磁珠，避免磁珠同上清一起被去除。

4.        从磁性分离架上取下离心管，打开管盖在室温下干燥 30 秒-3 分钟，除去残留的乙醇。

干燥时间不可过长，室温较高或空气干燥的环境下可以适当缩短干燥时间，残留乙醇会影响下一步的检测反应。

u  洗脱

1.        沿离心管壁加入100-150 μL 70 ℃预热的洗脱液，用漩涡振荡器轻微振荡5 秒使磁珠和洗脱液混匀，70 ℃水浴 7 分钟，水浴过程中可再次振荡混匀 2-3 次。

振荡后需将残留于管壁上的磁珠和洗脱液轻甩至管底。

振荡至管盖上的磁珠和洗脱液需快速离心后重新震荡混匀。

2.        孵育完成后，将离心管高速离心 1 分钟，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头小心转移溶液到干净的离心管中。

3.        将上一步获得的离心管快速离心 10 秒，然后静置于磁性分离架上，待磁珠分离后，用枪头再次转移溶液到干净离心管，所得即为样品纯化液。

收集洗脱液时，应将离心管内溶液转移完全，离心管内不得残留液体，否则将影响样品检测的准确性。

若样品残留较高，可用洗脱液将纯化液进行适当稀释，使其检测值落在标曲范围以内。

（二）操作过程（rHCDpurify®前处理系统）

u  提取准备

按照下述 96 深孔板排布预先加入相应溶液：

其中：

第 1 或 7 列：工作结合液 209.2 μL/孔，异丙醇 200 μL/孔，消化后的全部样品

第 2 或 8 列：洗涤液 A 700 μL/孔

第 3 或 9 列：洗涤液 B 700 μL/孔

第 4 或 10 列：磁珠 30 μL/孔

第 5 或 11 列：洗脱液 150 μL/孔

样品可在其他试剂全部加完后再加。

u  程序启动

1.        电源键打开—点击“登录”输入账号及密码—进入主界面。

2.        75%酒精棉球擦拭仪器内壁—点击“紫外灯”—选择“15 分钟”。  此步骤可在提取准备操作之前进行。

3.    将加好样的 96 深孔板放入仪器中固定位置，并把塑料套管插入磁头对应位置。

4.        点击“运行”—选择“rHCD-193”程序—扫描试剂盒上二维码—仪器运行。

5.    程序结束，发出“嘀嘀”声，立即取出深孔板，将样品纯化液全部转移到新的离心管内。

注意要点

1.        建议将实验室内部进行分区，分为阴性区（阴性对照样品处理、PCR 试剂的配制、阴性模板加样）、阳性区（样品操作）、扩增区等，做好明显的标识。每个区域配备独立的设备、试剂及耗材，不得交叉使用。实验试剂、待测样品、PCR 产物应分开存放，不应放于同处。减少在实验区内不必要的走动，以降低污染发生概率。

2.        实验开始前确保实验室环境温度不低于 22 ℃。

3.        实验过程中选择最合适尺寸的手套并及时更换，在不同实验区域或进行模板操作后都应更换实验服、口罩、帽子及手套，以避免不同实验区域交叉污染。

4.        装有试剂的离心管在打开之前应先瞬时离心，将管壁及管盖上的液体离至管底，降低污染手套或移液枪的风险；谨慎开关反应管，防止管内液体溅出或形成气溶胶导致污染。

5.        使用过的枪头及废液必须经过消毒液浸泡消毒后，在远离实验室的场所丢弃或统一处理。

6.        PCR 扩增完成后，需戴上一次性手套将 PCR 管取出，观察管盖是否紧闭，管壁有否破裂，确保产物没有外漏，之后丢弃在指定处，严禁开盖。

7.        在磁性分离架上分离磁珠时，过程中可缓慢旋转离心管，加速磁珠聚集。

8.        DNA 洗涤和洗脱操作时，每次振荡混匀后，都应该瞬时离心，以保证没有磁珠或液体附着于离心管盖或管壁上。

9.        在去除乙醇干燥时，观察磁珠状态，勿让磁珠太干，以免洗脱时不完全溶解。

10.    请尽量在完成样品纯化处理当天进行后续的 DNA 检测，以保证检测结果的准确性。

11.    rHCDpurify 程序启动前，检查 96 深孔板和套管是否固定好。

12.    rHCDpurify 仪器工作前及完成后需要紫外灭菌至少 15 分钟，并使用 75%酒精棉球将仪器内壁擦拭干净。且两次提取实验间隔至少为 30 分钟。

13.    rHCDpurify 程序运行完毕后，需立即取出 96 深孔板并将洗脱液转移至新的离心管。 96 深孔板第 5 或第 11 列壁上可能会出现冷凝水珠，该现象不会影响提取效果，只需将底部洗脱液转移出来即可，且保证多于 40 μL，确保检测时所需。

常见问题

修订日期：2023 年 05 月 18 日

生效日期：2023 年 06 月 01 日