本试剂盒用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中CHO宿主细胞DNA残留片段大小分布的专用试剂盒。
本试剂盒利用PCR荧光探针法原理，设计了四个不同的扩增片段（95bp、110bp、215bp、523bp）来定量检测分析样本中CHO残留DNA片段的大小分布情况。配套有CHO DNA定量参考品，与宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用。
SHENTEK® CHO 残留 DNA 片段分析检测试剂盒用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 CHO 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。
本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四个不同的扩增片段（95 bp、110 bp、 215 bp、523 bp）来定量检测分析样品中 CHO 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 CHO DNA 定量参考品。本试剂盒与宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。
4 ×100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
n适用机型（包括但不限于以下机型，使用前需验证检测灵敏度）
Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø CFX96 定量 PCR 系统
Ø Linegene 9600 plus 定量 PCR 系统
Ø 1.5 mL 或 2.0 mL 无菌低吸附离心管
Ø 八联管或 96 孔 qPCR 板
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
Ø 超净台或生物安全柜
Ø 迷你离心机
Ø 微孔板离心机
Ø 漩涡振荡器
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
1.穿戴无 DNA 污染的工作服、一次性乳胶手套、一次性无纺布帽子。
2.工作台面、移液枪及离心管架紫外照射 30 分钟，喷洒 75%酒精并擦干。
3.将试剂盒从冰箱-18 ℃以下区域转移至 2-8 ℃区域或冰上融化，涡旋振荡混匀并瞬时离心。
1.根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线 + 1 个无模板对照 NTC + 1 个阳性质控PCS +待测样品 + 1 个阴性质控 NCS +待测样品（加标））× 3
2.根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：
qPCR MIX =（反应孔数 + 2）× 20 μL
3.参考表 2、3、4、5 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX：
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 CHO DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：
1.将试剂盒中的 CHO DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下融化。待完全融化后，涡旋振荡混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。
2.取 6 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3.在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 CHO DNA 定量参考品稀释至 3 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
4.在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180 μL DNA 稀释液。
5.按表 6 依次进行 5 次稀释操作。
片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。
CHO DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行温育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
1.各试剂轻微振荡混匀，选择对应扩增片段并参考表 7、8、9、10 进行加样。加样完成后每孔总体积为 30 μL。孔板排版方式可参考表 11。
* 本示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、1个阳性质控 PCS、1 个阴性质控 NCS、2 个待测样品、2 个待测样品（加标）。每个检测做 3 个重复孔。
*板 1 的 1-3 列为 qPCR MIX-95 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个阳性质控 PCS，4-5 列为样品和加标样品，6 列为 1 个无模板对照NTC 和 1 个阴性质控NCS； 7-9 列为qPCR MIX-110 各浓度梯度的DNA 标准曲线和 1 个阳性质控PCS，10-11列为4-5 列为样品和加标样品，12 列为1 个无模板对照NTC 和1 个阴性质控NCS。
*板 2 的 1-3 列为 qPCR MIX-215 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个阳性质控 PCS，4-5 列为 4-5 列为样品和加标样品，6 列为 1 个无模板对照 NTC 和 1 个阴性质控 NCS；7-9 列为 qPCR MIX-523 各浓度梯度的 DNA 标准曲线和 1 个阳性质控 PCS，10-11 列为 4-5 列为样品和加标样品，12 列为 1 个无模板对照 NTC 和 1 个阴性质控 NCS。
*为满足同步进行四种扩增片段检测，DNA 模板需≥120 μL，建议每个样品同时准备 2 管进行前处理，提取完成后混匀。
2.八联管盖上管盖或将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10秒后放入 qPCR 仪。
1、以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1） 点击“实验向导”。
2）“孔板编辑”页面中选择检测 CHO-95 反应孔，选择步骤 2 项目中的“CHO SIZE-95 bp” 程序； 选择检测 CHO-110 反应孔， 选择步骤 2 项目中的“CHO SIZE-110 bp”程序；选择检测 CHO-215 反应孔，选择步骤 2 项目中的“CHO SIZE-215 bp”程序；选择检测 CHO-523 反应孔，选择步骤 2 项目中的“CHO SIZE-523 bp”程序。
3） “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
2、其他定量 PCR 系统程序设置如下：
选择 FAM 通道代表 CHO 检测信号，选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号。
1） 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2）） 四组 qPCR MIX 创建新检测探针， 分别为命名为 qPCR MIX-95 、qPCR MIX-110、qPCR MIX-215、qPCR MIX-523，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none。检测参比荧光为 ROX（可选）。
3） 设置三步法反应程序：
95 ℃ 15 秒，60 ℃ 30 秒，72 ℃ 1 分 30 秒（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。
六、结果分析
1、以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1） “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并进行赋值。“CHO SIZE-95 bp、CHO SIZE-110 bp、CHO SIZE-215 bp、 CHO SIZE-523 bp”分别设为 300、30、3、0.3，0.03，并在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。
2） 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3） 在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4） 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
2、以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
1） 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，Analysis Settings 选择 Manual Ct， Threshold 设置为 0.02，选择 Auto Baseline，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2）在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、 ST5（qPCR MIX-95、qPCR MIX-110、qPCR MIX-215、qPCR MIX-523）。
3）在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击
。
4）在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5）在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/10 μL。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μL 或 pg/mL。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
1.标准曲线
相关系数平方（R2）＞0.990，扩增效率（En）为 83.3%~110.0%。
2.质控样品
NTC、NCS、PCS 的结果分析参考表 12。
3.待测样品
待测样品的结果分析参考表 13。
若待测样品 Ct-IPC 值与 NCS 样品 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
质控标准应基于实验室验证数据，可从满足检测限要求考虑。
如遇特殊样品或其他异常现象，结果难以判定，可联系湖州申科，咨询具体解决方案。
修订日期：2023 年 05 月 11 日
生效日期：2023 年 05 月 15 日
400-829-0116
