本试剂盒用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中E.coli宿主细胞DNA残留片段大小分布的专用试剂盒。

本试剂盒利用PCR荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（85bp、103bp、220bp、550bp）来定量检测分析样本中E.coli残留DNA片段的大小分布情况。配套有E.coli DNA定量参考品，与宿主细胞残留DNA样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒简介

SHENTEK® E.coli 残留DNA 片段分析检测试剂盒是用于定量分析检测各种生物制品的中间品、半成品和成品中 E.coli 宿主细胞 DNA 残留片段大小分布的专用试剂盒。

本试剂盒利用 PCR 荧光探针法原理，设计了四种不同的扩增片段（85bp、103bp、 220bp、550bp）来定量检测分析样品中 E.coli 残留 DNA 片段的大小分布情况。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 E.coli DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用。

n  试剂盒组分

n  规格

4×100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

Ø Linegene 9600plus 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5ml 低吸附无菌离心管

Ø 96 孔 qPCR 板

Ø 1000μl，100μl，10μl 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 1000μl，100μl，10μl 移液枪

n  操作过程

v E.coli DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备

 片段分析试剂盒中含有四种不同长度的扩增片段，在建立标曲时，需分别对不同的扩增片段设置标曲，并根据对应扩增片段的标曲来计算其残留量和分布相对量。

E.coli  DNA  定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 E.coli DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 3ng/μl、300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl，30fg/μl。具体操作如下：

1.       将试剂盒中的 E.coli DNA 定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5s，如此重复 3 次。

2.       取 6 支干净的 1.5ml 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。

3.       在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 E.coli DNA 定量参考品稀释至 3ng/μl，振荡混匀后短时间快速离心 3~5s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.       在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分别加入 180μl DNA 稀释液。

5.       按表 2 依次进行 5 次稀释操作。

表 2. E.coli DNA 定量参考品的稀释

 已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃。

 若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37℃条件下进行孵育。

 标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

v 阴性质控 NCS 的制备

1．取 100μl DNA 稀释液加入 1.5ml 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。

 阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化

液。

v  qPCR 反应液（qPCR MIX）的制备

1.       根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +

待测样品）×3

2.       根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：

qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20μl

3.       各试剂放在冰上或 2-8℃条件下融化，并参考表 3、4、5、6 所示准备对应扩增片段的 qPCR MIX：

表 3. qPCR MIX-85 配制表

表 4. qPCR MIX-103 配制表

表 5. qPCR MIX-220 配制表

表 6. qPCR MIX-550 配制表

 为满足同步进行四种扩增片段检测，DNA 模板需≥120μl，建议每个样品同时准备 2 管进行前处理，提取完成后混匀使用。

v  加样

1.       各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，选择对应扩增片段参考表 7、8、9、10 所示加样。

表 7. MIX-85 各反应孔加样示例

表 8. MIX-103 各反应孔加样示例

表 9. MIX-220 各反应孔加样示例

表 10. MIX-550 各反应孔加样示例

 加样完成后每孔总体积为 30μl。

表 11. 96 孔板排版示例

 该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的 DNA 标准曲线、1 个无模板对照 NTC、1个阴性质控 NCS、1 个待测样品。每个检测做 3 个重复孔。其中 1~3 列为 qPCR MIX-85， 4~6 列为 qPCR MIX-103，7~9 列为 qPCR MIX-220，10~12 列为 qPCR MIX-550。

 实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

2.       将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10s 后放入 qPCR 仪。

v  qPCR 程序设置

² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.    点击“实验向导”。

2.    “孔板编辑”页面中选择检测 E.coli SIZE-85 反应孔，选择步骤 2 项目中的“E.coli

SIZE-85bp” 程序； 选择检测 E.coli SIZE-103 反应孔， 选择步骤 2 项目中的“ E.coli SIZE-103bp”程序；选择检测 E.coli SIZE-220 反应孔，选择步骤 2 项目中的“E.coli SIZE-220bp”程序；选择检测 E.coli SIZE-550 反应孔，选择步骤 2 项目中的“E.coli SIZE-550bp”程序。

3.    “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

² 其他定量 PCR 系统程序设置如下：

选择 FAM 通道代表 E.coli 检测信号，选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号。

1.    创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.    四组 qPCR MIX 创建新检测探针，分别命名为 qPCR MIX-85、qPCR MIX-103、 qPCR MIX-220、qPCR MIX-550，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none，检测参比荧光为 ROX（可选）。

3. 设置三步法反应程序：95℃预变性 10min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s

（读取荧光），40 个循环；反应体积 30μl。

v  qPCR 结果分析

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并进行赋值。“E.coli SIZE-85bp、E.coli SIZE-103bp、E.coli SIZE-220bp、E.coli SIZE-550bp”设为 300、30、3、0.3，0.03，并在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、 ST3、ST4、ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μl。

² 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在Results 的Amplification Plot 面板中，Analysis Settings 选择Manual Ct，Threshold设置为 0.02，选择 Auto Baseline，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在

Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3（含义为每孔的 DNA 总量，单位为 pg），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.                            在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距

（Intercept）、R²。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/10μl。后续可在检测报告中将单位换算为 pg/μl或 pg/ml。

6.       以 qPCR MIX-85 的待测样品检测值为 100% ， 计算 qPCR MIX-103 、qPCR MIX-220、qPCR MIX-550 的待测样品百分比。

7.       分析 IPC 的 Ct 值，正常情况下样品 Ct-IPC 值应在 NCS Ct-IPC 值±1.0 范围内。若样品 Ct-IPC 值与 NCS Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

8.       阴性质控 NCS、无模板对照 NTC FAM 信号的 Ct 均值大于标曲最低浓度 FAM 信号 Ct 均值或扩增曲线无明显起峰，VIC 信号为有效的“S”型扩增曲线。

 上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2022 年 11 月 10 日