产品信息：
• 检测类型：定量检测
• 产品规格：100测试
• 适用样品类型：对各种生物制品及药品的中间品、半成品和成品中残留的猪源细胞DNA进行分析。
• 线性范围：30fg/μL~3000pg/μL；R2≥0.990；扩增效率为94.7%
• 样品回收率：50-150%
• LLOQ：3.00×10-2pg/μL
• 专属性：不受Bovine、293T、HEK293等常见工程细胞基因组DNA的干扰。
• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在30%以内。
• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。
• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Thermo ABI7500、Bio-Rad CFX-96、Roche LightCycler480
产品特点：
• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。
• 灵敏度高：定量下限低至3.00×10-2pg/μL，满足实际检测需求。
• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。
• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。
质量保证：
• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。
• 生产度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。
SHENTEK®猪源残留 DNA 检测试剂盒是用于定量检测各种生物材料（如生物修复膜、生物补片、脱细胞基质等）中猪源 DNA 的专用试剂盒。
本试剂利用 PCR 荧光探针法原理，定量检测样品中残留的猪源 DNA。检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 fg 水平。试剂盒配套有 Porcine DNA 定量参考品。本试剂盒与动物源性生物材料残留 DNA 提取试剂盒（磁珠法）配套使用。
100 Reactions。
规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。
Ø SHENTEK-96S 实时荧光检测系统
Ø 7500 Real-Time PCR System
Ø 1.5 mL 无菌离心管
Ø PCR 八联管或 96 孔 qPCR 板
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头
Ø UNG 酶（确定使用前建议验证酶效果）
Ø 荧光定量 PCR 仪
Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪
n 操作过程
v Porcine DNA 定量参考品的稀释和标准曲线的制备
Porcine DNA 定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。
用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将 Porcine DNA 定量参考品进行梯度稀释，稀释浓度依次为 30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL，30 fg/μL。具体操作如下：
1. 将试剂盒中的Porcine DNA 定量参考品和DNA 稀释液置于冰上或2-8℃条件下融化。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3~5 s，如此重复 3 次。
2. 取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5， ST6。
3. 在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 Porcine DNA 定量参考品稀释至 30 ng/μL，振荡混匀后短时间快速离心 3~5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。
4. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。
5. 按表 2 依次进行 6 次稀释操作。
已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8℃。
若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37℃条件下进行孵育。
标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。
根据需要设置 ERC 中的 Porcine DNA 加样浓度（以制备加 30 ng Porcine DNA 量的样品 ERC 为例），具体操作如下：
1. 取 100 μL 样品基质溶液（或 DNA 稀释液）加入 1.5 mL 干净的离心管中，
2. 再加入 10 μL ST1，混匀，标记为样品 ERC。
样品 ERC 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成样品 ERC 纯化液。
根据实验设置阴性质控，具体操作如下：
1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中，标记为阴性质控 NCS。 
阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理，制备成阴性质控 NCS 纯化液。
1. 根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。
2. 根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：
3. 各试剂放在冰上或 2-8℃条件下融化，并参考表 3 所示准备 qPCR MIX：
1. 各试剂置于冰上，轻微振荡混匀，按表 4 所示加样：
加样完成后每孔总体积为 30 μL。
该示例表示的是检测各浓度梯度的 DNA 标准曲线（ST1~ST6）、1 个无模板对照 NTC、5 个待测样品（S1~S5）和每个样品的 ERC（S1 ERC~S5 ERC）、1 个阴性质控样品 NCS。每个检测做 3 个重复孔。
实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。
2. 将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。
² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。
1. 点击“实验向导”。
2. “孔板编辑”页面中选择步骤 1：选择反应孔。
3. 选择步骤 2：选择项目中的“猪源残留 DNA”程序。
4. “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。
² 其他定量 PCR 检测系统程序设置如下：
1. 创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。
2. 创建新检测探针，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none；创建新检测探针，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。
3. 设置两步法反应程序：25℃ UNG 酶作用 10 min（可选）；95℃预变性 10 min； 95℃ 15 s，60℃ 40 s（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。
各实验室可根据所用机型设置合理的反应程序。
若检测体系里加入 UNG 酶，反应程序需要设置一步 25℃ UNG 酶作用 10 min。
1. “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，例如“猪源残留残留 DNA”设为 3000、300、 30、3、0.3、0.03，并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。
2. 待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。
3. 在“实验分析”页面点击
，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。
4. 在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。
1. 在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。
2. 在 Results 的 Plate 面板中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为 Standard，并且在 Quantity 一栏分别赋值为 3000、300、30、3、0.3、0.03（含义为每孔的模板浓度，单位为 pg/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。
3. 在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name一栏中命名为 NTC、NCS、S1、S2、S3、S4、S5，之后点击
。
4. 在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取各标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。
5. 在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 pg/μL。
6. 分析 IPC 的 Ct 值，待测样品的 Ct-IPC 均值与 NCS 的 Ct-IPC 均值在±1 个 Ct 值范围内。若样品 Ct-IPC 均值与 NCS Ct-IPC 均值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。
7. 阴性质控 NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。
8. 无模板对照 NTC 的检测结果应为 Undetermined 或 Ct 值≥35，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。
上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。
修订日期：2023 年 01 月 16 日
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