产品信息：

• 检测类型：定量检测

• 产品规格：100测试

• 适用样品类型：对各种基因及细胞治疗产品的慢病毒载体制备中残留的质粒DNA进行分析。

• 线性范围：4.97×101~4.97×106 copies/μL；R2≥0.990；扩增效率为94.3%

• 样品回收率：50-150%

• LLOQ：9.94 copies/μL

• 专属性：不受CHO、E.coli、Vero、HEK293、毕赤酵母等常见工程细胞基因组DNA的干扰。

• 精密度：中间精密度及重复性实验CV值均在30%以内。

• 耐用性：至少反复冻融5次检测性能不受影响。

• 仪器适用性（包括但不限于以下设备）：湖州申科SHENTEK-96S、Bio-Rad CFX-96、Thermo ABI7500、Roche LightCycler480、耶拿qTOWER3G

产品特点：

• 操作简单：搭配SHENTEK前处理设备及试剂盒，可实现自动化提取及检测。

• 灵敏度高：定量下限低至9.04 copies/μL，满足实际检测需求。

• 性能稳定：试剂盒重复实验间结果稳定，均满足精密度需求。

• 质量可控：试剂盒按照药典、法规完成各项检测指标的性能验证。

质量保证：

• 建立ISO13485质量管理体系，具有完善的从研发、生产、质检的产品开发流程。

• 生产高度设备化，历史多批次生产稳定，供应链完善。

n  试剂盒简介

SHENTEK®质粒DNA 残留检测试剂盒用于定量检测基因治疗产品中质粒DNA 残留的专用检测试剂盒，如 CAR-T 细胞治疗中慢病毒载体制备相关的质粒 DNA。

本试剂盒利用 Taqman 探针原理，通过各质粒共有 DNA 序列， 如 ColE1/pMB1/pBR322/pUC 来源的复制子，定量检测样品中质粒 DNA 的残留。客户可以事先将质粒 DNA 序列给本公司技术人员进行确认。本试剂盒检测快速，专一性强，性能可靠，最低检测限可以达到 102 copies/μL。试剂盒配套有质粒 DNA 定量参考品。本试剂盒与 SHENTEK®宿主细胞残留 DNA 样本前处理试剂盒配套使用，可准确定量样品中残留的微量质粒 DNA。

n  试剂盒组分

n  规格

100 Reactions。

n  有效期

规定储存条件下 24 个月，具体详见试剂盒标签。

n  适用机型（包括但不限于）

Ø SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统

Ø 7500 Real-Time PCR System

Ø CFX96 定量 PCR 系统

Ø Linegene 9600 定量 PCR 系统

n  实验所需但试剂盒中未含材料

Ø 1.5 mL 无菌离心管

Ø 96 孔 qPCR 板或八联管

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 无菌低吸附带滤芯枪头

n  相关设备

Ø 荧光定量 PCR 仪

Ø 迷你离心机

Ø 漩涡振荡器

Ø 1000 μL，100 μL，10 μL 移液枪

n  操作过程

v  Plasmid DNA  定量参考品的稀释和标准曲线的制备

Plasmid 线性化DNA 定量参考品：将 Plasmid 线性化DNA 定量参考品快速离心 15 s，准确移取 55 μL ddH2O 加至管底，溶解冻干粉。

为保证冻干粉充分溶解，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次，再静置 10 min 后使用。

定量参考品浓度标注于管壁标签上，请确认浓度后再进行稀释。

用试剂盒中提供的 DNA 稀释液将定量参考品进行稀释，具体操作如下：

1.       将试剂盒中的定量参考品和 DNA 稀释液置于冰上或 2-8 ℃条件下。待完全融化后，轻弹数下混匀，短时间快速离心 3-5 s，如此重复 3 次。

可根据自身样品结构特性选择线性化或非线性化 Plasmid DNA 定量参考品配制标曲。

2.       如使用 Plasmid 非线性化 DNA 定量参考品，取 7 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST、ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。如使用 Plasmid 线性化 DNA 定量参考品，则取 8 支干净的 1.5 mL 离心管，分别标记为 ST，ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5， ST6。

3.       在 ST 管中用 DNA 稀释液将定量参考品稀释至 4.97×108copies/μ，得到 ST，振荡混匀短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次。再在 ST0 管中用 DNA 稀释液将 ST 稀释 10 倍，得到 ST0，振荡混匀后短时间快速离心 3-5 s，重复 3 次以确保定量参考品与 DNA 稀释液充分混匀。

4.       在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6 管中分别加入 90 μL DNA 稀释液。

5.       按表 2 依次进行 5 次稀释操作。

已融化未使用的 DNA 稀释液可保存于 2-8 ℃。

若 DNA 稀释液中有析出，建议于 37 ℃条件下进行孵育。

标准曲线浓度点可根据实际验证结果选择，应至少有 5 个浓度点。

v  阴性质控 NCS 的制备

根据实验设置阴性质控，具体操作如下：

1．取 100 μL DNA 稀释液加入 1.5 mL 干净的离心管中标记为阴性质控 NCS。

阴性质控 NCS 和同批待测样品一起进行样品前处理步骤，制备成阴性质控 NCS纯化液。

v  qPCR 反应液的制备和加样

1.       根据所要检测的标准曲线及待测样品数量，计算所需反应孔数，一般做 3 个重复孔/样。

反应孔数=（5 个浓度梯度的标准曲线+ 1 个无模板对照 NTC+ 1 个阴性质控 NCS +待测样品）×3

2.       根据反应孔数计算本次所需的 qPCR MIX 总量（含有 2 孔的损失量）：

qPCR MIX =（反应孔数+2）× 20 μL

3.       各试剂置于冰上或 2-8 ℃条件下融化，轻微振荡混匀，按表 3 所示配制：

4.       上述试剂混匀，按表 4 所示加样：

加样完成后每孔总体积为 30 μL。

v IPC  组反应液的制备和加样

NCS 和待测样品均需做 IPC 检测，根据表 5 和表 6 配制。

加样完成后每孔总体积为 30 μL。

该示例表示的是检测 5 个浓度梯度的质粒 DNA 标准曲线（ST1-ST5）、1 个无模板对照 NTC、1 个阴性质控 NCS、2 个待测样品（S1，S2）、NCS 的 IPC（IPC-NCS）和待测样品的 IPC（IPC-S1，IPC-S2）。建议做 3 个重复孔。

实际检测时可根据样品多少，参照此示例进行 96 孔板排版加样。

v  上机

将 96 孔板用光学膜封闭，轻微震荡混匀，短时间快速离心 10 s 后放入 qPCR 仪。

v  qPCR 程序设置

² SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       点击“实验向导”。

2.       “孔板编辑”页面中选择质粒非线性化检测反应孔，选择步骤 2 项目中的“质粒非线性化残留 DNA-FAM ”程序；或在“孔板编辑”页面中选择质粒线性化检测反应孔，选择步骤 2 项目中的“质粒线性化残留 DNA-FAM ”程序。选择检测荧光基团 VIC 样品反应孔，选择步骤 2 项目中的“质粒残留 DNA-IPC”程序。

3.       “实验运行”页面中点击“开始”运行程序。

其他定量 PCR 系统程序设置如下：

选择 FAM 通道代表 Plasmid 质粒检测信号，选择 VIC 通道代表 IPC 检测信号。

1.       创建空白新程序，选择绝对定量检测模板。

2.       创建新检测探针，命名为 plasmid-DNA，选择报告荧光基团为 FAM，猝灭荧光基团为 none。创建新检测探针，命名为 IPC，选择报告荧光基团为 VIC，猝灭荧光基团为 none；检测参比荧光为 ROX（可选）。

3.       设置两步法反应程序：95 ℃预变性 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min（读取荧光），40 个循环；反应体积 30 μL。

v  qPCR 结果分析

² 以 SHENTEK-96S 实时荧光 PCR 检测系统、软件版本 8.2.2 为例。

1.       “孔板编辑”页面中步骤 3：定义反应孔，将标准曲线孔的选择样品类型设置为标准品，并在标品赋值中分别根据表 2 赋值，如非线性 DNA 标准曲线设为 2.98e+006、 2.98e+005、2.98e+004、2.98e+003、2.98e+002（单位为 copies/μL），并且在相应的“样本名称”中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。

2.       待测样品将样品类型设置为待测样品，NTC 将样品类型设置为无模板对照。

3.       在“实验分析”页面点击，可读取标准曲线的斜率、截距、相关系数、扩增效率。

4.       在“反应孔信息表中”可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品的检测值，单位为 copies/μL。

² 以 7500 Real-Time PCR System、软件版本 1.4 为例。

1.       在 Results 的 Amplification Plot 面板中，将 Threshold 设置为 0.02，点击 Analyze，此时可初步查看扩增曲线的形态是否正常。

2.       在Results 的Plate 中，将标准曲线孔的 Task 一栏设置为Standard，并且在 Quantity一栏分别根据表 2 赋值，非线性 DNA 标准曲线设为 2.98e+006、2.98e+005、2.98e+004、 2.98e+003、2.98e+002（单位为 copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5。线性 DNA 标准曲线则设为 4.97e+006、4.97e+005、4.97e+004、 4.97e+003、4.97e+002、4.97e+001（单位为 copies/μL），并且在相应的 Sample Name 一栏中命名为 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6。

3.       在 Results 的 Plate 面板中，将无模板对照 NTC 孔的 Task 一栏设置为 NTC，将阴性质控 NCS 孔、待测样品孔的 Task 一栏设置为 Unknown，并且在相应的 Sample Name一栏中命名为 NTC、NCS、S，之后点击。

4.       在 Results 的 Standard Curve 面板中，可读取标准曲线的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。

5.       在 Results 的 Report 面板中，Mean Quantity 一栏可读取无模板对照 NTC、阴性质控 NCS、待测样品，单位为 copies /μL。

6.       样品的Ct-IPC 值与NCS 的Ct-IPC 值要求在±1 个Ct 值范围内，如样品的 Ct-IPC值与 NCS 的 Ct-IPC 值相比明显增大，则表明样品可能有抑制。如同时测试加标样品，则优先考虑样品回收率结果，IPC 结果作为参考。

7.       NTC 检测均值应不超过 10.61 copies/μL，或根据实验室自身验证结果设定具体标准。NCS 的 Ct 均值应大于标曲最低浓度 Ct 均值，若经验证的定量限浓度低于标曲最低浓度，则 NCS 的检测值应小于定量限浓度。

上述示例结果分析的参数设置仅供参考，具体需依据实验室机型及使用的软件版本进行设定，一般也可由仪器自动判读。

修订日期：2023 年 04 月 19 日

生效日期：2023 年 04 月 28 日